Testarea comprehensivă prin tehnica NGS a bolilor monogenice

Context Științific

    Bolile genetice au constituit intotdeauna o problemă sensibilă atât pentru pacient cât şi pentru familia acestuia.
In ultimile decenii medicina a făcut progrese remarcabile teoretice şi practice în ceea ce priveşte bolile genetice.
Genetica a demonstrat unicitatea biologică a fiecărui individ, mutaţiile fiind demostrate ca o cauză majoră de boală sau predispoziţie la boală.
Majoritatea bolilor genetice sunt boli rare dar, în ansamblul lor, afectează ȋntre 5 şi 8% din nou născuţi/ an, devenind astfel o problemă de sănătate publică.
[Covic M et al, 2017]

    Bolile genetice monogenice sunt produse de mutaţia germinală unei singure gene din genomul nuclear. Aceste mutaţii se pot transmite în familie, în succesiunea generaţiilor, după model mendelian.

Testarea genetică în bolile genetice endocrine

    Scopul acestei testări constă în detectarea spectrului mutaţional şi ȋmbunǎtǎţirea protocoalelor ȋn patologia endocrinǎ de cauză monogenică, dar nelimitandu-se la aceasta, utilizand tehnici moderne de diagnostic.

    Luând ȋn considerare dificultatea stabilirii precoce a diagnosticului complet genetic, a extinderii bolii posibil la toată familia (transmiterea monogenică), a caracterului invalidant asociat si nu in ultimul rand a costurilor implicate, se impune directionarea eforturilor catre diagnosticul precoce a patologiei monogenice, către un plan de îngrijire personalizată a pacientului şi nu în ultimul rând către sfatul genetic pentru pacient şi familiei acestuia.

  • Confirmarea unui diagnostic clinic si endocrin

    Mai ales atunci cand caracteristicile clinice sunt ambigue

  • Bolile rare

    O provocare diagnostica daca se bazeaza doar pe trasaturi clinice si testele diagnostice conventionale.

  • Identificarea indivizilor presimptomatici

    Poate fi prezis riscul de a dezvolta o boala endocrina mostenita si pot fi luate masuri profilactice (de ex. tiroidectomie la purtatorii anumitor variante ale genei RET)

  • Calculul riscului de transmitere a bolii la descendenti

    Și recomandările de testare prenatală

  • Poate contribui la intelegerea patofiziologiei bolii

    Și dezvoltarea și aplicarea unei terapii adaptate

  • Poate contribui la intelegerea patofiziologiei bolii

    Și dezvoltarea și aplicarea unei terapii adaptate

  • Rata de detecție în testarea diagnostică genetică a crescut

    Odată cu introducerea NGS în clinică, la un cost rezonabil

  • Testarea genetică a devenit o componentă indispensabilă a evaluării diagnostice comprehensive

    În endocrinologia pediatrică, dar și la adult, alături de analizele biochimice de laborator.

Impact

  • Lărgirea sferei de cunoaștere a patologiei monogenice

  • Reducerea cheltuielilor prin prevenţia aparitiei complicatiilor

  • Creșterea speranței de viață şi a calităţii vieţii pacientului

  • Reducerea costurilor prin diagnosticul ţintit al patologiei în familia pacientului cu stabilirea unui algoritm personalizat de investigaţii în fiecare caz în parte, în scopul de a minimiza complicaţiile şi costurile aferente acestora dar şi de a scădea impactul psihologic şi emoţional din familie, determinat de diagnosticul genetic

Obiectivele generale ale acestei testări

  • Îmbunǎtaţirea protocolului de diagnostic al bolilor monogenice cu componentǎ endocrinǎ ȋn vederea personalizǎrii tratamentului şi a managementului medical al pacientului

  • Extinderea diagnosticului molecular al afecţiunii pacientului selectat utilizând o metodǎ comprehensivǎ de genotipare

  • Diseminarea rezultatelor obtinute, completarea spectrului mutaţiilor şi raportarea lor ȋn bazele de date internaţionale, conectarea comunității naționale cu cea internațională pentru a facilita deschiderea şi colaborarea ȋn cercetarea ȋn domeniu

Materiale și metode

TruSight One Sequencing Panel

Utilizează tehnica NGS ce acopera 12 Mb de conţinut genomic, incluzând peste 4800 gene asociate cu fenotipuri clinice specifice pentru sindroame monogenice.

Etapele NGS

    Investigarea şi diagnosticul bolilor genetice monogenice reprezintă o adevarata provocare pentru personalul medical şi presupune in practica uzuala urmatoarele etape:

  • Evaluarea clinică de către medic

  • Testarea biochimică şi eventual imagistică

  • Evaluarea clinică de către medicul genetician

  • Eventuala excludere a unei alte etiologii genetice

    (cromozomiale clasice, sindroame de microdeleţii/ microduplicaţii, anomalii de amprentare etc) atunci când este cazul (patologii cu expresivitate variabilă, suprapuneri fenotipice, pleiotropie genetică)

  • Identificarea variantelor modificate utilizând tehnica NGS (secvenţiere de nouǎ generaţie) printr-un panel extins de gene

  • Interpretarea rezultatelor

  • Valorificarea rezultatelor

Extractia ADN

Extractia ADN

Pregatirea librariilor

Pregatirea librariilor

Secventiere

Secventiere

Cartografiere („mapping”)

Cartografiere

(„mapping”)

Obtinerea variantelor („variant calling”)

Obtinerea variantelor („variant calling”)

Adnotare („annotations”)

Adnotare („annotations”)

Filtrarea variantelor

Filtrarea variantelor

Prioritizarea variantelor

Prioritizarea variantelor

Rezultate așteptate

  • Îmbunǎtǎţirea diagnosticului molecular al cazurilor selectate prin identificarea variantelor genice implicate ȋn patologia pacientului

  • Îmbunǎtǎţirea protocolului de evaluare şi diagnosticare a bolii la pacienţii dar şi testarea ţintitǎ a membrilor familiei acestora

  • Contribuţii la efortul general de cercetare prin raportarea mutaţiilor ȋn bazele de date internaţionale ȋn spiritul OpenScience.

Rezultate intermediare

    Pana în acest moment au fost efectuate peste 50 de testări ale pacientilor care au fost inclusi de catre medicul genetician in proiectul de Testare comprehensivă prin tehnica NGS a bolilor monogenice pe baza analizei nevoilor acestora de a beneficia sau nu de acces la testarea comprehensivă prin tehnica NGS.

    În cadrul Congresului de genetică de la Timișoara din 2023 au fost prezentate lucrări despre Testarea comprehensivă prin tehnica NGS a bolilor monogenice realizată în cadrul Institutului Național de Endocrinologie “C. I. PARHON”.

    În cadrul zilelor stiintifice ale Institutului National de Endocrinologie “C. I. PARHON” 2022 au fost prezentate date si rezultate intermediare ale proiectului.

    Date importante despre Testarea comprehensivă prin tehnica NGS a bolilor monogenice au fost prezentate in “prime-time” in cadrul editiei de stiri a unei importante televiziuni nationale.

    În cadrul unui eveniment stiintific de la sfarsitul anului 2023, un juriu avand componenta internationala, a conferit marele premiu “proiectul de cercetare al anului 2023”.

Randamentul diagnosticului prin NGS = 30-45%

De ce nu este 100%?

  • Varianta nu există

    Cauza bolii nu este varianta pentru o genă cu penetranta mare

  • Varianta cauzatoare a fost prezentă în datele brute de secvențiere, dar nu e în lista finală

    (QC poate elimina o varianta adevarată care nu a fost suficient de puternică în datele brute)

  • Varianta cauzatoare a fost identificată, dar a fost greșit clasificată de soft-urile de predicție ca ne-patogenaă

    (predicțiile patogenice nu sunt perfecte)

  • Varianta e prezentă dar nu a fost detectată

    (e prezentă într-o regiune inaccesibilă cu metodele convenționale de NGS)

  • Varianta cauzatoare este într-o secvență necodificatoare

    (promotor, 5’-UTR, 3’-UTR, situs splice activat profund dintr-un intron, non-coding RNA scurt sau lung, non-coding DNA ce afectează o regiune reglatoare)

Strategiile de testare genetică pentru bolile endocrine (selecție)

Boli genetice adrenale
Boala Gena/reg. crz Strategia de testare genetica
Carcinom adrenocortical TP53 1. Secventierea unor exoni specifici
2. Panel NGS
Sindrom poliendocrin autoimun tip 1 AIRE 1. Secventierea unor exoni specifici
2. Panel NGS
Complex Carney PRKAR1A 1. Secventierea unei singure gene
2. Analiza CNVs
3. Panel NGS
21OHD CYP21A2 Secventierea unei singure gene. Analiza CNVs
Homeostazia calciului si a fosforului
Boala Gena/reg. crz Strategia de testare genetica
Hiperparatiroidism, hiperparatiroidism neonatal, hipoparatiroidism familial izolat, hipercalcemie hipocalciurica, pseudohipoparatirodism CDC73, CASR, GCM2, GNA11, AP2S21 Panel NGS
Pseudohipoparatiroidism GNAS Teste de metilare, secventierea unei singure gene, analiza CNV
Rahitism hipofosfatemic autozomal dominant FGF23 secventierea unei singure gene
Rahitism hipofosfatemic X-linkat dominant PHEX secventierea unei singure gene
Boli genetice hipofizare
Boala Gena/reg. crz Strategia de testare genetica
Deficit combinat de hormoni hipofizari PROP1, POU1F1, HESX1, altele Panel NGS
Adenom hipofizar familial izolat AIP Secventierea unei singure gene
Boli genetice tiroidiene
Boala Gena/reg. crz Strategia de testare genetica
Hipotiroidism congenital non-gusa TSHR, SLC5A5, PAX8, altele Panel NGS
Homeostazia glucozei si insulinei
Boala Gena/reg. crz Strategia de testare genetica
MODY (diabet de tip adult al tanarului) HNF1A, GCK, HNF4A 1. Secventierea unei singure gene 2. Panel NGS 3. CNVs
Diabet zaharat neonatal tranzitoriu 6q24 (PLAG1), KCNJ11, ABCC8 1.Test de metilare 2. Secventierea unei singure gene 3.Panel NGS
Diabet zaharat neonatal permanent KCNJ11, ABCC8, GCK, INS, PDX1 Panel NGS
Tumori endocrine
Boala Gena/reg. crz Strategia de testare genetica
Neoplazia endocrina multipla tip 1 MEN1 1. Secventierea unei singure gene 2. CNVs 3. Panel NGS
Neoplazia endocrina multipla tip 2 RET 1.Testarea pentru variante specifice (C634R) 2. Secventierea unei singure gene
Neoplazia endocrina multipla tip 3 RET 1.Testarea pentru variante specifice (M918T) 2. Secventierea unei singure gene
Neoplazia endocrina multipla tip 4 CDKN1B Vezi MEN1
VHL VHL 1. Secventierea unei singure gene 2. CNVs 3. Panel NGS
Feocromocitoame/ paraganglioame MAX, MAD, SDHA, SDAF2, SDHB, SDHC, SDHD, TMEM127, altele Panel NGS
Crestere, obezitate si metabolism
Boala Gena/reg. crz Strategia de testare genetica
Sindrom Noonan PTPN11, SOS1, RAF1, RIT1, altele Panel NGS
Sindrom Silver-Russell 11p15.5 1. Test de metilare
2. Microarray
3. WES
Sindrom Prader-Willi 15q11.2 1. CNVs
2. Test de metilare
Deficit izolat de hormon de crestere tip 1A, 1B, 2, 4 GH, GHRHR Secventierea unei singure gene
Deficit de IGF1 IGF1 Secventierea unei singure gene
Rezistenta la IGF1 IGF1R Secventierea unei singure gene
Dezvoltare sexuala si maturizare
Boala Gena/reg. crz Strategia de testare genetica
Boli de dezvoltare sexuala SRY, AR, altele 1. Citogenetica
2. Secventierea unei singure gene
3. Panel NGS
Sindrom Turner 45,X Citogenetica
Sindrom Klinefelter 47, XXY Citogenetica